1、真空手套箱分為主箱體和過渡室兩部分。主箱體不能抽真空，過渡室則可以單獨抽真空。
　　2、先將手套套入手套孔上,再用喉箍將其固定,如果條件允許,最后在手套的外圍加一圈與喉箍相同寬度的橡膠圈(或片),這樣可以防止手套被勒破,延長手套的使用壽命。
　　3、將實驗所需用的儀器及設備從過渡室放置并轉移到主箱體內,較大設備需要從主箱體開門的一側放入,另外放入適量的實驗樣品用作箱體環境的測試。
　　4、在主箱體充氣結束后,即主箱體達到了實驗所需環境,關閉主箱體進出氣口,打開過渡室外門,將實驗所用材料放入過渡室后關閉外門,以達到和主箱體相同的實驗環境。
　　5、此時打開過渡室內門,將過渡室內的實驗材料取放到主箱體內,開始實驗操作.操作時關閉過渡室內門。
　　6、實驗結束后先打開過渡室內門,將實驗結束后的材料放入過渡室,關閉過渡室內門,然后打開過渡室外門,將實驗材料取出.關閉過渡室外門,實驗操作結束。
　　7、關閉主箱體,過渡室所有開門及閥門,將惰性氣體瓶接入手套箱進氣閥門,先打開手套箱主箱體進氣閥門,然后緩緩打開惰性氣體瓶閥門,慢慢往主箱體內充氣,此時根據手套的鼓漲程度還確定是否需要打開手套箱另一側的排氣孔,此時可以試著將手套帶在手套往箱體內擠壓,由于這種方法一兩次內可能無法達到實驗所需要的環境,所以建議多重復幾次,期間可以實驗樣品來測試是否達到了實驗所需要的環境。